前言
心脑血管疾病是全球第一大死亡原因，年在全球范围内共有多万人死于心脑血管疾病，这个数字逐年递增，估计到年全球因为心脑血管疾病死亡的人数将达到万。在美国，男性心肌梗死的死亡率达27%，女性为44%。在我国，每年死于心脑血管病的人数约为万人，每年需要进行溶栓治疗的人数超过万，心脑血管疾病已成为对人类健康的最大威胁之一。研制和生产高效的溶栓药物成为临床的迫切要求。
1了解血液凝固和纤溶过程
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血液凝固
一系列无活性酶原转变为激活酶的连锁反应过程，凝血过程大体分三个阶段：
①第一阶段为凝血活酶形成。
1）外源性凝血途径2）内源性凝血途径。上述两种途径激活FX，凝血过程即进入共同途径。
②第二阶段为凝血酶形成凝血酶的形成是凝血连锁反应的关键。
a.反馈性加速凝血酶转变；
b.诱导血小板的不可逆性聚集，加速其活化；
c.激活因子Ⅻ；
d.激活因子XIII，加速稳定性纤维蛋白形成；
e.激活纤溶酶原，增强纤溶活性。③第三阶段为纤维蛋白形成。
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纤溶系统
纤维蛋白被血浆中纤溶系统分解液化的过程称为纤维蛋白溶解，简称纤溶。
纤溶可分为纤溶酶原的激活与纤维蛋白（或纤维蛋白原）的降解两个阶段。纤溶的生理意义主要是防止血栓形成，保证血流畅通，并有利于受损组织的再生和修复。
（一）纤溶酶原的激活
纤溶酶原是存在于血浆中的一种无活性的球蛋白，需被激活成纤溶酶。能使纤溶酶原激活的物质统称为纤溶酶原激活物。主要有以下三类：
组织型激活物
由小血管内皮细胞合成和释放。
尿激酶型激活物
主要由肾血管和集合管上皮细胞产生。
依赖于XII激活物
如因子XIIa、激肽释放酶。
（二）纤维蛋白与纤维蛋白原的降解
在纤溶酶作用下，纤维蛋白和纤维蛋白原可被分解为许多可溶性小肽，总称为纤维蛋白降解产物（FDP）。这些产物通常不再发生凝固，且具有抗凝作用。
（三）纤溶抑制物
血浆中有多种抑制纤溶的物质，统称为纤溶抑制物。主要有两类：一类为抗纤溶酶，能使纤溶酶失去活性；另一类为纤溶酶原激活物抑制物，能抑制纤溶酶原的激活。
正常情况下，血凝与纤溶处于动态平衡。当血管受损，其内面有少量纤维蛋白形成时，纤溶系统激活使纤维蛋白溶解，保持血流畅通，并有利于组织修复和血管再生。若两个系统之间的平衡被破坏，即可出现凝血或出血。
2市场上溶栓药物品种
市场上的溶解血栓产品的种类：可以分为三大类（1）抗凝药物（2）抗血小板聚集（3）溶栓药物。
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抗凝药物
通过影响凝血因子，从而阻止血液凝固过程的药物，主要用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗。抗凝药物主要有肝素、低分子量肝素（如依诺肝素、替地肝素、弗希肝素、洛吉肝素、洛莫肝素等）、香豆素类（如双香豆素、华法林、醋硝香豆素等）。
（资料来源日信证券抗凝血药物分类）
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抗血小板聚集
抗血小板聚集药物常用于高危人群的血管栓塞的治疗，更重要的是预防患者的再梗塞率及死亡率，防止心脏瓣膜置换术术后血栓形成、外周闭塞性血管疾病、间歇性跛行、不稳定型心绞痛等的治疗。与此同时，在这一领域中，对于膝、髋关节置换手术和腹部手术后深层静脉血栓的预防也有了较快的进展。
（资料来源日信证券抗血小板聚集药物分类）
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溶栓药物
血液中含有两种纤溶酶原激活剂PA，一种是来自血管内皮细胞的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA），另一种是由肾细胞分泌的单链尿激酶纤溶酶原激活剂（scu-PA），在正常情况下血液中只有少量PA，生成微量可以降解不溶性纤维蛋白的纤溶酶Pm，而纤溶酶原激活剂抑制剂PAI和α2-抗纤溶酶（α2-AP）这两种抑制剂占优势，并保持该系统平衡。
正常情况下当血管受损时，启动体内凝血机制，血小板及纤维蛋白在各种因子相互作用下形成血块以止血，而当血管没有受损的情况下，体内在某种条件刺激下也会形成血块并随着血液循环全身，这就是血栓。当血栓循环到特定部位就会阻碍血流循环，会造成组织缺氧甚至造成组织坏死，如果发生在脑血管那就是脑梗，在心血管就是心肌梗死，通常病情发展非常突然而且紧急，而溶栓药物就可以起到激活纤溶系统，达到溶解血栓的目的，可以有效缓解病症，及时恢复组织供氧。适应的疾病表征包括：急性心肌梗塞、脑血栓、肺静脉栓塞、动脉栓塞和缺血性休克等，其中急性心肌梗塞（AMI）的死亡率高达30%，治疗血栓最有效的方法是溶栓。
1组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）主要功能结构域
t-PA：由血管内皮细胞合成，成熟分子中含个氨基酸残基，分子量为67~72KD，由单条肽链组成，含17个二硫键。在溶纤过程中，N端个氨基酸残基形成重链，C端和氨基酸形成轻链，轻、重链之间由一个二硫键相连。重链含4个结构域。轻链含催化纤溶酶原中心。
四个重要功能结构域：
①指形区（F区）由4~46位氨基酸残基组成，含纤维蛋白结合位点。
②表皮生长因子区（E区），由47~85位氨基酸残基组成，含细胞膜受体结合微店。该区介导t-PA与肝脏细胞和血管内皮细胞结合，对半衰期有重要影响。
③K1区由92~位氨基酸残基组成。
④K2区由~位氨基酸残基组成，含纤维蛋白结合位点。
t-PA在体内至少和一下四种不同蛋白质相互作用：
1.纤溶酶原：是t-PA的底物，在无纤维蛋白时，与它有较低的亲和力；
2.纤维蛋白：t-PA与其有较高的亲和力，并且在与其结合后t-PA的蛋白酶活性可提高倍左右。
3.纤溶酶原激活剂抑制物PAI：t-PA与其结合后蛋白酶活性受抑制。
4.t-PA受体：存在于肝细胞和血管内皮表面细胞，介导t-PA在体内快速清除。
由于t-PA与纤维蛋白具有高度亲和力并且其活性可被纤维蛋白大大提高，因此，他在一定浓度范围内只激活血栓附近的纤溶酶原使血栓溶解，而不会引起全身的出血倾向，比其他的纤溶酶原激活剂更加安全有效。
2溶栓药物的发展
溶栓药物大致经历了三代的发展：
第一代溶栓药以链激酶（SK）及尿激酶（UK）为代表，可以直接或间接激活纤溶酶原使之转变为具有溶栓活性的纤溶酶溶解纤维蛋白，达到溶栓的目的。Pm在其生成过程中直接受循环中α1-纤溶酶抑制物（α1-PI）-作用而灭火，只有Pm大量产生超过α1-PI的作用时，才能游离于血中发挥其溶纤作用。在溶解纤维蛋白时将血中纤维蛋白原同时降解，因此招致全身纤溶亢进，此中溶纤作用被成为液相纤溶，对局部纤维蛋白亲和力低，缺乏特异性。其他还有蚓激酶，尿激酶原，葡激酶，甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂，蛇*抗栓酶等。
特点：对栓塞性疾病有一定的疗效，价格较为便宜，主要不良反应是引起机体广泛出血，尤其是颅内出血的风险很大。尿激酶用于脑栓赛效果明显，不良反应较链激酶少。
第二代溶血栓药物以尿激酶原和alteplase（阿替普酶t-PA）为代表，t-PA是一种重组组织性纤溶酶原激活剂，这是世界上第一个基因重组溶栓药，由美国Genetech公司开发上市，由于该药需要在真核细胞中表达，工艺要求高，而且临床使用剂量大，所以在生产上存在一些问题。t-PA在本世纪初，由德国勃林格翰公司经销进入我国市场，商品名“爱通立”，为国家医保乙类品种，属于急性心梗（AMI）12小时内急救药。阿替普酶目前国内外适应症研究较为充分，已经获批应用于急性心肌梗塞（AMI）、缺血性脑卒中和肺栓塞三种疾病治疗。全国各地药品招投标价约为元/20mg和元/50mg
国内天士力研发的一类新药注射用重组人尿激酶原（商品名“普佑克”）于年获批上市，目前在各省的最新中标价是1元/5mg（50万IU）左右。
特点：对血栓部位有一定的选择性，在症状发作后需短时间内回复缺血再灌注作用明显，半衰期短（约3min），短时间内需大量给药，价格昂贵，引起颅内出血的风险较大。
目前溶栓药物发展到第三代。年德国宝灵曼公司研制的Reteplase（商品名瑞替普酶）为代表，是阿替普酶基因缺失产品。它是一种蛋白质修饰药物，为重组人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂缺失变异体，由个氨基酸残基组成，单链，无糖基化，分子量为39kD，利用原核表达系统。
相对于天然t-PA，在体内的半衰期延长4~5倍，但与纤维蛋白的结合能力降低了5倍，具有半衰期长、溶栓作用强，副作用小等优点，但在临床应用上有一定的局限性。年上市，但是后来销售额不断下降，现几乎下架。国内主要有北京爱德（益佰制药旗下）和阿华生物（东阿阿胶旗下）两家制药企业生产，招投标品规为~1元/支（5MU）需静脉注射，但要分两次间隔30分钟缓慢注射。比阿替普酶的血栓纤维特异性下降了4倍，但是半衰期提高了。
后续改进版的TNK-tPA（替奈普酶）以DNA重组技术、CHO细胞表达系统为产业化平台，是当今世界安全性、特异性和敏感性最高的新一代生物基因溶栓药物。它的原研公司是美国基因泰克（Genentech）公司，并在0年于美国上市后相继登录欧洲、日本和加拿大市场。经10年临床应用，其疗效与安全性已得到广泛验证。之后国内广州铭康生物和天阶生物也开始利用基因重组技术研制TNK-tPA（替奈普酶）（商品名分别是“铭复乐”“宜真通”）。它的半衰期更长，溶栓作用更快更彻底，颅内出血较少。
3广州铭康生物分析
1与竞争对手世贸天阶生物比较
广州铭康生物的“铭复乐”和天阶生物的“宜真通”都属于替奈普酶类（TNK-tPA），是利用基因工程方法对天然蛋白进行特定位点突变而改变蛋白与其他蛋白结合能力的大小而达到目的。
常见突变方式主要有以下几种：
①非糖基化位点突变为糖基化位点。如将苏氨酸位点突变成天冬酰胺，这种突变延长t-PA的半衰期，但也降低与纤维蛋白结合的能力。
②增强t-PA对纤维蛋白的结合能力，最重要的改变其对拮抗剂的拮抗能力，如将赖氨酸、组氨酸精氨酸突变为丙氨酸。
通常采用大肠杆菌E.coli表达t-PA缺失突变体，属于原核表达系统。该技术是通过DNA重组缺失天然t-PA的部分结构域，如F区、E区、K1区，使之仅含有K2功能域和蛋白酶功能域，此缺失突变体t-PA是一个单链、非糖基化的分子，相对于天然t-PA，在体内的半衰期延长4~5倍，但是与纤维蛋白的结合能力降低了5倍，因此在临床应用上有一定的局限性。
而这两款第三代溶栓产品均采用真核表达系统（CHO），技术难度更大。天阶生物利用基因工程定点突变技术，改造全长天然t-PA基因，并将改造好的基因转入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞中CHO（dhfr-）广州铭康也用类似的基因工程技术。
天阶生物采用贴壁式、高密度、连续灌流培养方式，40L的生物反应器连续收液L，每批次80g约支产品。广州铭康的细胞培养是悬浮细胞培养，先在转瓶中形成一定大小的细胞团块替代微载体培养工艺，提高细胞密度，延长生产周期，后续使用5L细胞反应罐过滤-沉降双结合连续灌流系统培养，收细胞上清约L/罐/批，平均批生产规模L。
2广州铭康生物技术优势
①工程细胞表达效率高
应用DNA重组技术，构建rhTNK-tPA真核表达质粒，转染CHO（dhfr-）细胞，筛选获得高效表达的工程细胞株。主要是将野生型t-PA第位氨基酸，位氨基酸和~位的氨基酸进行定点突变，得到TNK突变体。此突变体其血浆清除速度降低为原来的1/4，对t-PA抑制剂的拮抗能力增强80倍，对纤维蛋白的特异性提高了14倍，体内溶纤活性提高了10~14倍，因而有更长的半衰期和更强的特异性，使用剂量降低，成为目前最有效的重组t-PA类溶栓药。
②建立新的细胞培养工艺
核心技术优势是建立了动物细胞在生物反应器中的无血清高密度连续灌流培养技术，此为生物制药发展的关键制约因素。由于天然t-PA分子结构比较复杂，含17对二硫键的糖基化分子。因为原核表达系统和真核表达系统在蛋白质的翻译、翻译后修饰及折叠的机制不同，从而使原核表达真核细胞蛋白时无法获得大量有活性的天然蛋白，而用哺乳动物表达体系能最大程度接近天然分子的活性。加上临床应用的有效剂量都很大，而哺乳动物表达体系的得率问题一直是技术瓶颈。
a.实现全程无血清培养
通过对工程细胞的筛选与驯化培养，获得可以在无血清培养基中持续生长高效表达的细胞株。有效避免使用动物血清引起的不良反应。
b.建立细胞结团培养和配套的灌流系统的专利技术
之前类似哺乳动物细胞培养均使用微载体技术培养，但是缺乏配套的灌流装置，铭康生物开发成本更低操作更便利的细胞结团技术加配套的连续灌流系统，使培养周期长（约天），可以连续不断收获培养产物，不需要太大的设备投入即能达到效果。
③高收率的纯化工艺
经三步色谱分离技术获得纯度98%以上的rhTNK-tPA纯品，收率达60%，蛋白浓度高达10mg/ml，比活5×IU/mg。
④冷冻干燥制剂工艺。
建立冷冻干燥制剂工艺，规格为1×IU/16mg/支。剂型为冷冻干燥粉，方便储存。溶解速度、水分含量、内*素和生物学活性均达到质量标准要求。
4国内市场情况分析
（1）作为凤毛麟角的1.7类生物制剂创新药，很有份量，能得到CFDA的首肯说明技术上有优势，但是在年已经拿到批文情况下，为何销售停滞了一段时间？这个时间点上的空白值得推敲。此项目开展已跨越十几年的时间，新药研发周期长、风险高，且投资巨大，所需要的投资动辄几千万或上亿元。已经投入那么多的情况下，现在马上柳暗花明的情况下，为何要卖掉？
（2）能否进入《基本药物目录》。目前我国创新药还不能直接进入医保目录，药物销量受到很大限制，企业不能在短期内回收巨大的前期研发成本。而同类产品“爱通立”已进入医保，无论对于医生还是患者来说，都比较容易接受。
（3）销售推广策略。所有新药刚开始推广都是比较困难的一件事。要改变医生的用药习惯，还必须先通过业内专家的首肯，如纳入临床指南、专家共识等。加上医患矛盾比较尖锐，医生也不愿意冒风险。鉴于现状，后续的销售推广策略很关键。
